摘要:在壳聚糖膜的表面接上分子链较长的双醛淀粉作为柔性固定化酶的载体，将木瓜蛋白酶固定在该载体上制成柔性固定化木瓜蛋白酶，并应用于酶解波纹巴非蛤制备小分子肽。通过考察温度、pH、加酶量和固定化时间等条件对柔性固定化木瓜蛋白酶的酶活、酶活回收率的影响，确定最优固定化条件。实验结果显示，双醛淀粉用量为0.8mg/g壳聚糖，柔性固定化酶温度为25℃，柔性固定化酶时间为20h，加酶量为40mg/g壳聚糖，pH为8.0的柔性固定化酶条件下所得的固定化酶酶活最高，酶活回收率63.35%;在酶解温度为40℃，pH为7.0，加酶量为1.0%，酶解时间为4h的条件下制备波纹巴非蛤小分子肽，产率为3.4055%。

　　关键词：壳聚糖;双醛淀粉;固定化酶;波纹巴非蛤;小分子肽;

　　运用绿色酶工程技术，是开发利用海洋生物蛋白资源的重要途径。蛋白质经蛋白酶酶解后，其产物肽类具有分子量低，易被机体吸收、生物活性强等优点，可以应用到食品、医药、化妆品等领域[1]。通过酶降解蛋白质的途径获得具有各种生理功能的生物活性肽是目前最常见的方法，如能在海洋蛋白生产中选用固定化酶技术，就不仅能使酶的稳定性有较大的提高，固定化体系也适合于连续化、自动化生产，酶催化过程有利于控制，这为实现海洋生物活性肽的产业化生产提供了极大的可能。波纹巴非蛤(Paphia undulata)是我国重要海洋贝类，从我国浙江麂列岛以南的整个沿海地区大量盛产，波纹巴非蛤不但营养丰富、味道鲜美，而且还有很多保健功能，具有重要的食用价值和药用价值，据我们的前期研究结果显示，以木瓜蛋白酶为工具酶，酶解波纹巴非蛤可制备具有较强生物活性的小分子肽[2]。目前未见运用固定化酶技术制备波纹巴非蛤小分子肽的报道[3]。

　　壳聚糖(Chitosan)属多糖类，是一种生物相容性好、安全无毒、易得的天然高分子生物材料，易于进行化学改性，引人新的功能团，如可发生酰基化、羧基化、醚化、醛亚胺化(Schiff反应)、N—烷基化、酯化、氧化、卤化、接枝共聚等反应，从而制得各种系列衍生物，也是一类性能优良的固定化载体[4]。

　　本文研究通过在壳聚糖(Chitosan)膜的表面接上分子链较长的双醛淀粉(Dialdehyde Starch，DAS)作为柔性固定化酶的载体，将木瓜蛋白酶固定在该载体上制成柔性固定化木瓜蛋白酶，并应用于酶解波纹巴非蛤制备小分子肽。通过测定其柔性固定化酶活力和酶活回收率，确定最优固定化条件，并测定酶解波纹巴非蛤软体部分所得小分子肽的产率。本研究为从分子水平去协调固定化材料表面结构与酶蛋白构效之间的关系做基础工作，为海洋蛋白资源的产业化深度开发做有益的探索。

　　1..试验部分

　　1.1试验材料、试剂及仪器设备

　　壳聚糖，脱乙酰度95.53%，浙江金壳生物化学有限公司;双醛淀粉，AR级，泰安市金山变性淀粉有限公司;冰乙酸、氢氧化钠、无水乙醇、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等均为AR级;木瓜蛋白酶，生化试剂(BR)，实测酶活200万U/g，广州威佳科技有限公司;半胱氨酸，生化试剂(BR)，国药集团化学试剂有限公司;酪氨酸(L-Tyrosine)，BBI，BIO BASIC INC;干酪素，生化试剂(CP)，国药集团化学试剂有限公司;

　　波纹巴非蛤，,购于佛山山紫市场，由中国科学院南海海洋研究所钟洪茂研究员鉴定;

　　550-Series红海外光谱仪，Nicolet公司;JJ-1增力电动搅拌器，江苏省金坛市宏华仪器厂;紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司;SH2-D(2)循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂;FA2004N电子分析天天平，上海精密仪器有限公司。

　　1.2柔性固定化酶载体的制备

　　1.2.1Chitosan薄膜的制备

　　称取2.5g的壳聚糖粉末，边搅拌边加入至100ml 8%的乙酸中，搅拌至完全溶解后可得到2.5%壳聚糖的乙酸液，将上述溶液量取15ml倒入直径为12cm的培养皿中，水平放置，待完全干燥后加入20ml 2.5% NaOH溶液浸泡4-5h，再将膜洗至中性。慢慢取出放在玻璃板上铺平后用滤纸吸去表面水份，再自然风干。将膜取出在50℃下干燥至恒重，密封保存备用。

　　1.2.2 柔性载体的制备

　　取出上述Chitosan薄膜2.50g，沿边缘剪成宽4mm细丝，加入0.80g双醛淀粉( DAS )到 150 ml 50%的乙醇溶液，于70℃下反应24h后，冷却到室温，充分洗涤，置于pH为8. 00的Tris-HCl缓冲液中浸泡备用[4]。

　　1.2.3柔性固定化载体的IR表征

　　取适量Chitosan膜、Chitosan-DAS膜和DAS于50℃下干燥至恒重后采用KBr压片法进行红外光谱分析。

　　1.3柔性固定化木瓜蛋白酶的制备[4-6]

　　称取2.50g柔性固定化载体加入到盛有150ml Tris-HCl缓冲溶液锥形瓶中，再加入30mg木瓜蛋白酶，在25℃下固定反应20h后，用大量蒸馏水洗涤，再用Tris-HCl缓冲溶液洗涤，得到柔性固定化酶，将柔性固定化酶置于Tris-HCl(pH=8.0)缓冲溶液备用。

　　1.4木瓜蛋白酶活力的测定方法和计算方法

　　本实验中的木瓜蛋白酶的一个活力单位(U)相当于单位时间内释放1μg的酪氨酸。游离酶活力、固定化酶活测定的测定方法参考文献[7-9]。

　　柔性固定化酶、游离酶活力及活力回收率按下式计算：

　　式中：

　　K——标准曲线的斜率

　　V——酶活力测定液的总体积(包括酶液、酪蛋白、激活剂、终止剂)

　　t——转化底物时间(10min)

　　m1(V1)——固定化酶(或游离酶)活力测定用量

　　m2(V2)——固定化酶(或游离酶)总量

　　1.5 柔性固定化酶法制备波纹巴非蛤小分子肽

　　1.5.1波纹巴非蛤酶解制备活性肽的工艺流程[3]：

　　原料波纹巴非蛤→预处理→加水匀浆→调节pH值→保温酶解→冷却→离心→加入磷钼酸后过滤→波纹巴非蛤酶解清液。

　　1.5.2波纹巴非蛤小分子肽分离测定方法

　　采用隆丁区分法分离提取小分子肽[10-13]，酶解液中蛋白质的测定采用半微量凯氏定氮法、酶解清液中游离氨基酸的测定采用甲醛滴定法[14]。

　　2. 结果和讨论

　　2.1柔性固定化载体的表征

　　壳聚糖膜、DAS、柔性固定化载体IR谱图分别见图1、图2、图3

　　图1 壳聚糖膜红外光谱图

　　Fig 1IR spectra ofChitosan

　　图2 DAS红外光谱图

　　Fig 2IR spectra of dialdehyde starch

　　图3 柔性载体红外光谱图

　　Fig 3 IR spectra of flexible support

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