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马钱子散对实验性骨折愈合骨痂局部BMP定量表达的影响
【关键词】 骨折愈合 马钱子散 安全剂量 骨形态发生蛋白 定量分析
【出   处】 2018年 1期
【收   录】 中国学术期刊网
【作   者】 覃旭1 赵新1 唐良华2 周凤鸣
【项   目】 暂不属于基金项目
【单   位】
【摘   要】   [摘要] 目的 观察马钱子散对骨折愈合过程中骨痂局部BMP的含量表达的影响,分析其促进骨折愈合的机理。 方法 45只新西兰兔随机分为随机分为正常组和模型组,其中模型组又分
正文

  [摘要] 目的 观察马钱子散对骨折愈合过程中骨痂局部BMP的含量表达的影响,分析其促进骨折愈合的机理。 方法 45只新西兰兔随机分为随机分为正常组和模型组,其中模型组又分为空白对照组和用药组。人工手术造成大白兔双桡骨10mm缺损的标准骨折模型。A组(正常组),B组(空白对照组),C组(用药组),正常组五只,空白对照组和用药组各20只。用药组以马钱子散26.27mg/kg调于20ml蒸馏水分早晚2次灌胃;空白对照组则用20ml蒸馏水分早晚2次灌胃。分别于骨折后第1、2、3、4及6周,取标本进行抗骨形态发生蛋白(BMP)单克隆抗体免疫组化染色, 通过图像分析系统对BMP含量进行定量分析。并以B组和C组作为对照组来比较分析各组促进骨折愈合的能力。 结果 正常组、用药组、空白对照组标本行免疫组化BMP染色(S-P法免疫组化染色),分割骨痂图像中BMP阳性产物区域,进行阳性产物平均光密度(代表BMP平均着色程度)、平均积分光密度(代表BMP的含量)比较,用药组骨折局部BMP含量明显高于空白对照组(P<0.01),用药组BMP高峰出现在第2周, 空白对照组出现在第3周。 结论 在安全有效剂量范围内使用马钱子散内服,能加快骨折修复细胞的分化、增殖,增加成骨细胞的活性,诱导骨折局部BMP合成,使BMP峰值提前,加速兔创伤性骨折的愈合,提高骨折愈合质量。

  [关键词] 骨折愈合 马钱子散 安全剂量 骨形态发生蛋白 定量分析

  [Abstract] Objective To investigate effect of fraction of nuxvomica powder on the local content of BMP expression in the process of fraction union, and to explore the mechanism of nuxvomica powder in enhancing fracture healing. Methods 45 New Zealand rabbits were divided into normal and model groups randomly, model group included the drug administration group and the blank control, 5 in the normal group,20 in the drug administration and the blank control model group . 40 New Zealand rabbits of the drug administration and the control group were selected to make radial fractures bilaterally with 10mm defect. The rabbits of drug administration model group were fed orally with nuxvomica powder (26.27mg/kg) and 20ml normal saline in the morning and evening.The rabbits of blank control model group fed 20ml normal saline in the morning and evening. When it was post of 1, 2, 3, 4, 6 weeks, both groups were respectively made general histological examination. The paraffin sections of them were stained with immuno-histochemical technique to manifest BMP for quantitative image analysis and take the group B and C as the contrast groups to compare and analyze the function of them in enhancing fracture healing. Results The image analysis result of immuno-histological BMP showed BMP content in the drug administration group was significantly higher than that of the blank control. The peak value of BMP in the drug administration group was appeared at the second week , and that in the blank control at the third week. Conclusions In the safe and effective scope, nuxvomica powder can promote the proliferation of fracture repairing cells in callus, increase the activity of osteoblast, induce the BMP synthesis, accelerate the fraction union of rabbit and elevate the quality of fraction.

  [Keybords] Fracture union Nuxvomica powder Safe dose BMP Quantitative analysis

  骨折愈合是一个极其复杂的生物学修复过程,由于基因技术的发展应用,人们对骨折愈合的研究已从细胞生物学水平深入到分子生物学水平。[1]骨形态发生蛋白(BMP)是最为重要的一种生长因子BMP具有很强的骨诱导作用,是目前所知骨诱导能力最强的生长因子。[2]马钱子是一味骨伤科常用的中药,经严格炮制,控制好剂量能明显促进骨折的愈合。但临床应用多为复方制剂,对单味马钱子促进骨折愈合的机理还不十分明确。本文旨在通过评价单味中药马钱子散在治疗家兔骨折模型的过程中,马钱子散对骨痂局部BMP含量以及骨折断端骨痂含量的影响,进一步探讨马钱子散促进骨折愈合的机理。

  1.材料与方法

  1.1马钱子散的制备

  马钱子为云南昭通产,经贵阳中医学院中药鉴定教研室鉴定为马钱科植物马钱正品(nuxvomica)。由贵阳中医学院第二附属医院药剂科按照《中华人民共和国药典 (2005年)》去皮毛,经砂烫后粉碎,再加适量淀粉稀释,调整其番木鳖碱含量为0.78%—0.82%,炮制成制马钱子散。

  1.2实验动物

  CL级(清洁级)健康成年新西兰大白兔45只,雌雄不限,平均重量2.0g—2.5kg左右,由贵阳医学院实验动物中心提供。单笼标准饲料喂养。

  1.3主要试剂、耗材及仪器

  优生级小牛血清(兰州民海生物制品有限公司)、鼠抗BMP单克隆抗体 工作浓度1:100(福州迈新生物技术开发公司)、S-P试剂盒(美国Vector公司)、德国Leitz1512 型病理组织切片机、计算机真彩色图像分析仪。

  1.4造模与分组

  提前一周单笼饲养45只实验动物以适应环境并观察确定有无疾病。一周后随机分为3组,A组(正常组)5只、B组(空白对照组)20只、C组(用药组) 20只。A组(正常组)为非手术组,不作任何处理,于第3周集中用断颈法处死;B组(空白对照组)和C组(用药组)分别于骨折后第1、2、3、4及6周,用断颈法每次每组处死4只兔。术前一天对B组(空白对照组)和C组(用药组)动物用脱毛剂脱净双侧前肢前段的兔毛,用普通天平对每只手术实验动物称重,按所作标记记录重量 。按50mg /kg盐酸氯胺酮、5mg /kg安定配比成混和液,以5ml /kg腹腔注射混合液麻醉实验大白兔,[3]麻醉生效后,固定实验动物于手术台,按骨科常规手术铺巾于双前肢。于兔的双侧桡骨中段外侧处做一个长约3.0cm的切口,切开皮肤、钝性分离皮下组织、肌肉、止血,避免损伤血管、神经和肌腱,用手术刀切开骨膜、分离骨膜,充分暴露桡骨中段,用消毒钢尺测量桡骨,于双桡骨旋前圆肌止点远端以消毒钢锯截除桡骨中段约10mm的桡骨干。生理盐水冲洗,充分止血,保护好周围软组织及尺骨,逐层缝合,不作内外固定。消毒敷料包扎伤口。术后肌注青霉素40万单位/日预防感染,共3天。伤口隔日换药1次,直至正常愈合。

  1.5给药

采用陈奇主编《中药药理研究方法学》所制定的实验动物与人临床用药剂量的体型系数换算公式dB=dA×(RB/RA)×(/),其中dB为欲求算动物的公斤体重剂量, dA为已知人公斤体重剂量, WA和WB分别为已知人与动物的体重,R为体型系数(人为0.11,兔为0.093)。按照标准人体重60公斤,兔2.0公斤,马钱子散在人的安全有效剂量10mg/kg[4]计算可得出马钱子在家兔实验中的安全有效剂量为26.27mg/kg,故用药组根据所得体重以马钱子散26.27mg/kg,用电子天平分取每只用药组实验动物安全有效剂量(以mg为单位,精确到小数点后两位)调于20ml蒸馏水分早晚2次灌胃;空白对照组则用20ml蒸馏水分早晚2次灌胃。

  1.6 S-P法免疫组化BMP染色

  分为第1、2、3、4和6周五个观察时段。分批于各观察时段以断颈法每次处死B组(空白对照组)、C组(用药组)各4只实验兔,第3周集中用断颈法处死A组(正常组)5只试验兔,用手术器械完整截取下右侧前肢,以骨痂处为中心,包括上下骨端各2cm,取出标本,剔除筋膜、肌肉和肌腱,保留外骨膜及骨痂。将标本置10%中性福尔马林液中固定48h后,再置于5%乙二胺四乙酸(EDTA)液中脱钙,脱钙彻底后冲洗。沿桡骨纵剖面切开,取包括整个骨痂切面2块组织,经酒精逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,5μm厚连续切片,切片进行免疫组化BMP染色(S-P法免疫组化染色)。鼠抗BMP单克隆抗体(BMP monoclonal atntibody BMP-McAb)由福州迈新生物技术开发公司提供(工作浓度为1∶100),S-P试剂盒由Vector公司提供,PBS代替第一抗体,染色结果为阴性。阳性结果为棕黄色。

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