摘要:选取DBT为柴油中含硫杂环化合物的模型化合物,从长期被石油污染的土壤中分离筛选出菌株XYZ-9,该菌株产生的酶能有效的脱除DBT和柴油中的硫,生理生化鉴定表明其为红球菌属。确定菌株XYZ-9对柴油脱硫的最适条件为:培养温度30~35℃、培养时间72h、pH7.0、接种量200mg/L。
关键词:生物脱硫;脱硫效率;红球菌属;柴油脱硫
柴油具有热值高、燃烧稳定性好等特点,但其含硫量高,严重污染环境。国内外利用BDS技术解决这一问题已有很多报道[1-4]。本文利用抚顺地域优势,筛选到一株具有专一性的脱硫菌,并确立了脱硫最佳条件,为柴油脱硫提供了研究基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源:抚顺石油一、二、三厂、加油站的油污土样。
1.1.2 培养基组成:
基础盐培养基BSM(mg/L):2.44KH2PO4,14.04 Na2HPO4•12H2O,0.20 MnCl2,2.00 NH4Cl,0.02 CaCl2,0.001 FeCl3•6H2O,0.01 NaCl,6.4 甘油。微量元素溶液母液5.0 ml/L,维生素溶液母液1.0 ml/L,pH值7.0~7.2。BSMD培养基:BSM中加入0.2 mmol/L DBT。微量元素母液(g/L):0.5 FeCl2•4H2O,ZnCl2,0.5 MnCl2•4H2O,0.1 NaMoO4•2H2O,0.05 CuCl2,0.05 NaWO4•2H2O,120 mmol/L HCl 。维生素母液(mg/L):400泛酸钙,200肌醇,400烟酸,400盐酸吡哆醇,200对氨基甲苯,0.5 VB12。固体培养基:相应培养基中加入琼脂20.0 g/L。
实验试剂:DBT,2-HBP,Gibb`s试剂,pH为10.0的磷酸缓冲液,广州石化直馏柴油。
1.2 实验方法
1.2.1菌株的驯化及筛选[5]
1.2.2菌株的观察与鉴定
将分离得到的菌株观察其菌落特征、菌体形态、染色反应及生理生化反应。
1.2.3 菌株脱硫率的测定[5]
2 结果与分析
2.1 菌种的筛选和鉴定
经反复驯化、富集和纯化得到13株具有脱硫能力的菌株,其中XYZ-9菌株的脱硫能力最稳定。菌株XYZ-9为革兰氏阳性菌,其菌落为圆形、表面光滑、呈红色,生理生化鉴定见表1,根据个体形态菌落形态和生理生化指标初步鉴定XYZ-9为红球菌属Rhodococcus sp.[6-7]。
表1 YZ-9的生理生化特征
试验项目
结果
试验项目
结果
试验项目
结果
试验项目
结果
革兰氏染色
阳性
碳水化合物产酸
+
水解明胶
-
丙酸盐
+
细胞形状
球形
亮氨酸
+
酯酶(Tween80)
+
阿拉伯糖
-
菌落颜色
红色
甘露糖
+
硝酸盐还原
+
蔗糖
-
与氧的关系
好氧
甘露醇
+
利用柠檬酸盐
+
海藻糖
+
接触酶
+
麦芽糖
+
精氨酸双水解酶
-
乳酸盐
+
氧化酶
-
乙酸盐
+
反硝化
-
谷氨酸
+
水解淀粉酶
-
山梨糖
-
葡萄糖
+
乙醇
+
水解洛素
-
苹果酸盐
+
乳糖
-
肌醇
+
注:+表示阳性,-表示阴性。
2.2 菌株XYZ-9脱硫条件的考察
2.2.1碳氮硫源对菌株脱硫性能的影响
对碳源、氮源、硫源等进行单因素考察见图1、图2和表2,确定最佳碳源为甘油、氮源为氯化铵、硫源为DBT。
图1 不同碳源对YZ-9生长的影响
图2不同氮源对YZ-9生长的影响
表2 不同硫源对YZ-9生长和脱硫率的影响
硫源
DBT浓度(mmol/L)
OD620
脱硫率%
MgSO4
1.0
3.24
45
DMSO
1.0
2.89
10
噻吩
1.0
3.67
36
DBT
1.0
4.52
56
2.2.2 培养温度对菌株脱硫性能的影响
保持其它条件不变,考察XYZ-9在不同温度下的生长及细胞对DBT脱硫的影响。由图3可知,在30~35 ℃之间,菌株XYZ-9脱硫性能最好。
图3 温度对XYZ-9的生长和2-HBP生成量的影响
2.2.3 PH值对菌株脱硫性能的影响
分别调整发酵液的pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0培养菌株。考察不同pH值对菌株生长的影响,由图4可知PH为7.0时,相对更适合脱硫。
图4 初始pH值对XYZ-9的生长和2-HBP生成量的影响
2.2.4接种量及培养时间对菌株脱硫性能的影响
从5.0 g/L的对数生长期种子菌液中,取出不同体积投加到50 mL的DBT浓度为0.5 mmol/L的BSMD培养基中,测定OD620和DBT脱除率,结果见表3。
表3 接种量及时间对XYZ-9生长和脱硫率的影响
时间(h)
24
36
72
接种量(mg/L)
OD620
脱硫率%
OD620
脱硫率%
OD620
脱硫率%
20
0.68
5.8
1.73
12.4
3.62
32.4
50
0.86
7.6
2.32
16.7
3.84
39.5
100
1.21
11.3
2.81
20.1
4.13
45.6
200
1.32
13.2
2.95
23.7
4.71
51.3
300
1.53
15.3
3.24
26.9
4.62
50.2
500
1.66
18.6
3.52
30.7
4.85
49.5
从表3我们可以看出,接种量为10 mg菌体/50 mL培养液,即200 mg/L时,培养72 h的脱硫率达到最大值,再增加接种量时, OD620和脱硫率变化不大。
3 结论
菌株XYZ-9为红球菌属,其脱硫最适条件为:培养温度30~35 ℃、培养时间72h、pH7.0、接种量200mg/L。从培养条件和脱硫条件考察可以看出,培养和脱硫条件与通常实际应用的培养和脱硫条件相符合,为进一步研究和应用奠定了基础。
参考文献
[1] 沈齐英,赵锁奇.石油产品生物脱硫技术现状[J].北京石油化工学院学报,2007,15(4):32~37.
[2] Denome,SA,C.Oldfield,LJ Nash,and KD Young.Characterization of the desulfurization genes from Rhodococcus sp. strain IGTS8[J]. Bacteriol, 1994, 17:6707~6717.
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[4] 于丽,李本高,肖宝清等.微生物方法脱除柴油中有机硫的初步研究[J].石油学报,2003,19(3):38~42.