摘要：碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)在化妆品中含量极少，并对紫外线敏感，本文建立了一种不同的化妆品样品前处理方法，采用高效液相色谱/二极管阵列检测器(HPLC/DAD)检测。使用C18反相色谱柱(5μm, 250mm×4.6mm)，以乙腈-水为流动相进行等度洗脱，用DAD检测器扫描检测。对样品前处理条件，如前处理方法、萃取剂种类、萃取剂体积进行讨论。以保留时间结合待测物的紫外吸收光谱进行定性分析，采用外标法进行定量分析，定量检测波长为204nm。所建立的方法可在10min内完成对化妆品的检测，被测防腐剂与化妆品杂质分离均达到基线分离。实验结果表明，在0.001～0.05mg/mL范围内，IPBC的质量浓度与相应的峰面积比值呈良好的线性关系。方法的平均回收率为109%~85%，相对标准偏差(RSD)为0.62%~4.93%，检出限为6.92×10-2mg/kg。

　　关键词：石油醚萃取;高效液相色谱法;碘丙炔醇丁基氨甲酸酯;化妆品

　　化妆品中脂类、烃、水溶性高聚物等有机组分，不但能够提供微生物生长所需的碳源、氮源等营养成分，又可为其生长提供化学能。在合适的环境中，化妆品中的微生物就会生长、繁殖、使其腐败变质。因此选择一个高效安全的防腐体系是配方师们建立一个稳定化妆品配方体系的关键[1]。本论文中防腐剂碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC，以下均用IPBC代替)由于其广谱高效防霉防腐功能，被越来越多的运用于化妆品中。美国FDA于1996年登记使用IPBC[2]，它与重氮咪唑烷基脲复配成Gemall Plus，与1,3-二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲(DMDMH)复配成Glydant Plus，增加防腐剂的有效性，抑制微生物的增长[3]。但是经国外研究机构进行人体皮肤测试[4]后发现，它们有可能导致过敏性接触传染和接触性皮炎。因此很多国家，如我国《化妆品卫生规范》(2007)[5]、欧洲EEC Cosmetics Directive[6]等对IPBC用于化妆品中的含量有着严格的规定。

　　目前，国内外文献报道采用气相色谱测定防腐剂 IPBC[7-11]和高效液相色谱/质谱检测器(HPLC/MS)定性检测化妆品中的防腐剂IPBC[12-14]。采用石油醚直接液液萃取-高效液相色谱法/二极管阵列检测器(HPLC/DAD)检测IPBC防腐剂的文献尚未见报道。本文根据不同化妆品样品特征，建立了石油醚直接液液萃取-高效液相色谱法/二极管阵列检测器(HPLC/DAD)对防腐剂IPBC进行检测的方法，以保留时间结合目标物的紫外吸收光谱进行定性，外标法定量。方法简单、快速、准确，能在复杂化妆品成分中有效提取和分离测定不同化妆品中的防腐剂IPBC。 实验部分 仪器与试剂 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)配二极管阵列检测器、自动进样器;离心机(上海安廷科学仪器厂);超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

　　碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(标准品，sigma)纯度97%;石油醚40~60℃(分析纯，化学试剂厂);乙腈(色谱纯，merck);氯化钠(分析纯，化学试剂厂);实验用水为Milli-Q Ⅰ级超纯水。 样品前处理方法 称取0.5~1g化妆品样品于50ml旋盖离心管中，加入10ml饱和食盐水，充分振荡后超声提取，再加入10ml石油醚，用力振摇使两相充分混合，加入5滴用水饱和的正辛醇，摇匀后静置至少1min，置于离心机中以7500r/min高速离心1min，取上层清液，过0.45μm滤膜过滤后供分析使用。 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，5μm， 250mm×4.6mm(i.d.);流动相：V(乙腈):V(水)=55:45;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;检测波长：204nm;进样量：20μL。 标准溶液的配置 准确称取IPBC标准品0.0500g，置于100ml溶量瓶中，流动相溶解，并稀释至刻度，配置成0.5mg/ml的IPBC标准储备液。移取上述标准储备液适量，配置成质量浓度分别为：0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.005mg/ml、0.020mg/ml、0.050mg/ml的标准系列。 结果与讨论 样品前处理条件的确定 前处理方法的确定 化妆品中限用防腐剂IPBC提取方法的选择是本研究的重点。根据文献[11]，首先尝试了甲醇直接提取，由于IPBC在化妆品中的含量极低，小于0.05%，而且化妆品基质较复杂，甲醇直接提取不仅重复性不好，且不能排除化妆品样品中其他成分对防腐剂IPBC的干扰，特别是提取膏霜、护法素等样品时，重复性更低。因而有必要采用其他的前处理方法。实验考虑采用环己烷、乙醚、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、石油醚作为萃取剂，饱和食盐水作为提取剂进行液液萃取。饱和食盐水作为提取剂是因为其密度比水大，能够减少乳化，并使样品更好的分散，且IPBC不溶于水，有利于有机溶剂的萃取。由于环己烷和乙醚作为萃取剂回收率较低，而且乙醚对人体伤害较大，因此本实验主要研究二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、石油醚，其萃取结果可通过图1得出。

　　由图1可以看出，含有相同浓度的IPBC样品溶解于30ml饱和食盐水，在IPBC提取率几乎相同的情况下，石油醚(d)携带萃取出的化妆品干扰成分明显比二氯甲烷(b)和1,2-二氯乙烷(c)萃取出的化妆品干扰成分少。达到了萃取的目的：即得到最高IPBC萃取率的同时有最少的化妆品杂质干扰。因此，最终选择石油醚作为萃取溶剂。

　　图1.四种不同萃取剂对同一化妆品样品中防腐剂IPBC色谱图对比

　　a 10ml甲醇直接提取; b 加标样品溶于30ml饱和食盐水，30ml二氯甲烷分三次萃取、有机相经旋蒸后，残渣用甲醇溶解定溶至10ml; c 与b前处理方法相同，除萃取剂换为1,2-二氯乙烷; d 与b前处理方法相同，除萃取剂换为石油醚。

　　Fig1. Comparison of chromatograms use four different extractant for the same cosmetics

　　a Direct extraction in 10 ml methanol; b Sample was resolved in a 30 ml saturate salt solution, liquid-liquid partitioning with 30 ml dichloromethane (10+10+10), the organic solvent was evaporated, residue was diluted to 10 ml with methanol; c The same as b, except exchanging 30 ml dichloromethane with 30 ml 1,2-dichloroethane; d The same as b, except exchanging 30 ml dichloromethane with 30 ml petroleum ether.

　　实验过程中，将30ml石油醚萃取一次得到的有机相，不经旋蒸直接进样分析，得到的回收率竟然能达到95%以上。因此，我们考虑采用石油醚相萃取后，不经旋蒸直接将石油醚相进样分析的方法。 提取溶剂及萃取剂体积的确定 选用的某膏霜作为样品，加标实验，通过回收率确定最佳提取剂及萃取剂体积，实验结果如表1所示：

　　表1. 不同体积石油醚和饱和食盐对膏霜中IPBC回收率实验

　　Table1. The recovery of IPBC in cream from using different volume petroleum ether and saturation salt solutions 饱和氯化钠溶液(ml) 石油醚(ml) 回收率(%) 30 30 98 20 98 10 93 20 20 99 10 93 10 20

　　10 91

　　96 表1中可以看出，不论饱和食盐水的体积是多大，萃取剂石油醚的体积加入量为10ml时，就能得到很高的回收率;并且IPBC作为防腐剂在化妆品中的加入量为非常少，为了提高检测的灵敏度，最终确定提取剂饱和食盐水为10ml，萃取剂石油醚为10ml。但值得注意的是，用相同的实验步骤对香波、护发素、乳液进行分析，这几类化妆品样品都会出现不同程度的乳化现象，使萃取率降低。因此，我们需想办法消除化妆品体系的乳化现象，提高回收率。 破乳方法的确定 查阅文献，常用的破乳方法有超声、加醇破乳以及离心分离等[15]。经过实验，超声破乳回收率不仅不高，体系中其余化妆品成分会溶解于石油醚中，石油醚的优点没有得以很好的体现。对于醇破乳，初步选择乙醇、异丙醇、正丁醇、正辛醇作为破乳剂，实验对比四个醇对同一化妆品样品的破乳能力，与正辛醇相比乙醇、异丙醇、正丁醇都需要加入较大的量才能有效破乳，而正辛醇只需加入几滴就能起到很好的破乳作用。对于一些乳化现象极为严重的化妆品，如洗发水、部分化妆水，加入正辛醇的基础上，再加以高速离心分离1min，乳状液完全分离，如图2所示。 液相色谱条件的确定 DAD测定波长的确定 选择扫描波长200～900nm对IPBC的标准溶液进行检测，全扫描波长的光谱图见图3，由吸光光谱图3可知：IPBC产生强吸收的波长为200nm，为获得较高的灵敏度和较少的干扰，选

　　择204nm为检测波长。

　　图2. 某品牌化妆水样品前处理实验现象对比

　　a称取0.5~1g化妆水样品于50ml旋盖离心管中，加入10ml饱和食盐水，充分振荡后超声提取，再加入10ml石油醚，用力振摇使两相充分混合，加入5滴正辛醇，轻轻摇匀后静置至少1min，置于离心机中以7500r/min高速离心1min，取上层清液，过0.45μm滤膜过滤后供分析使用;b 与a同样的步骤，但没有加入正辛醇。

　　Fig2.Comparison of experimental phenomenon of a lotion pre-treatment

　　a 0.5~1g sample of a cosmetic product was taken in a 50 ml centrifuge tube. The ingredient was extracted in a 10 ml petroleum ether by shaking it well after adding 10ml of saturate salt solution phase, then adding 5 drops of n-octanol. after brief shaking and standing at least 1 min, this mixture was centrifuged at 7500 rpm for 1 min. Approx. 2 ml of the suppernant were passed through a 0.45μm syringe filter; b The same as a, except adding n-octanol.

　　图3. IPBC标准溶液全扫描波长的光谱图

　　Fig3. Spectrogram of IPBC standard solution 流动相组成及配比的确定 在其他条件相同的情况下，对甲醇-水和乙腈-水这两种流动相进行比较，实验表明，甲醇因为本身有紫外吸收，会让噪音增大，一般不适合用于低波长(低于210nm)的检测条件，因此选定乙腈-水体系。

　　以化妆品中的杂质与标准样品的分离度为依据，考察不同配比的乙腈和水，实验结果表明流动相比例为V(乙腈):V(水)=55:45时分离度最佳。所选流动相，不仅具有较好的分离度、分析时间段(仅需10min)，且基线平、灵敏度高、定量好。 柱温及流动相流速的确定 实验结果表明，柱温为25～40℃时分离效果都很好，本方法采用的柱温为30℃。兼顾时间、柱压和分离效果，最佳流速选择为1.0ml/min。 IPBC对紫外线的敏感性 文献[16]中报道，IPBC对紫外线敏感，由于化妆品平时使用时可能受阳光光照影响，本文使用同一时间段的阳光对IPBC标液进行不同时长照射，进行色谱分析，得到表2数据。

　　表2. IPBC紫外线照射影响研究

　　Table2. Study of the influence of UV irradiation on IPBC 同一时间段阳光

　　照射时长 相对峰面积比a 5min 98 10min 98 15min 95 25min 93 45min 86 1h 86 3h 83 4h 82 5h 82 注：进行试验的IPBC浓度为0.05mg/ml

　　aIPBC给定时间阳光照射后得到色谱峰面积比上最初没有进行照射色谱峰面积(色谱图来自HPLC分析)

　　Note.Initial concentration of IPBC was 0.05mg/ml

　　aPeak area (%) (from HPLC-DAD analysis) after given irradiation time vs that for the initial,non-irradiated IPBC

　　从表2中可以看出，IPBC峰面积受阳光照射减小不是很显著，但为避免引起实验误差，IPBC标液配制好应该储存在没有阳光直射的地方，防止其分解。 方法的线性关系与检出限 准确称取IPBC标准品0.0500g，置于100ml溶量瓶中，流动相溶解，并稀释至刻度，配置成0.5mg/ml的IPBC标准储备液。移取上述标准储备液适量，配置成质量浓度分别为：0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.005mg/ml、0.020mg/ml、0.050mg/ml的标准系列。在上述色谱条件下测定IPBC标准系列溶液，标准溶液色谱图见图4。

　　图4. IPBC标准溶液色谱图

　　Fig4.Chromatograms of IPBC standard solution

　　以IPBC质量浓度(x，mg/ml)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标作图，IPBC标准溶液的工作曲线见图5，其线性方程和相关系数分别为y=8.47×103x-0.30和R=0.999 9。

　　图5. IPBC标准溶液的工作曲线

　　Fig5. Working curve of IPBC standard solution

　　由图5可见，IPBC质量浓度在0.001mg/ml～0.050mg/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系。在上述条件下，以仪器S/N=3计算，IPBC的仪器最低检出限为3.46×10-6mg/ml。由样品前处理最低的回收率和浓缩倍数关系确定方法的检出限为6.92×10-2mg/kg。 精密度与回收率实验 向0.5g四类型8种化妆品空白样品中分别加入质量浓度为0.5mg/mL的IPBC标准溶液0.5ml、1ml、1.5ml，按上述方法检测各进行2次平行实验，考察方法的回收率和精密度，结果见表3。从表3中可以看出，该方法的平均回收率为109%~85%，相对标准偏差为0.62%~4.93%。 实际样品检测结果 选取10个不同种类的化妆品样品，均匀溶解于饱和食盐水中，直接用石油醚萃取，萃取液经0.45μm滤膜过滤后，HPLC-DAD分析，采用外标法定量。所检化妆品样品中，有5个化妆品样品检出IPBC，其含量为0.01～0.02%，均低于化妆品卫生规范中最大限用量0.05%。实际样品的色谱图见图6。

　　图6. 含防腐剂IPBC实际样品检测色谱图(a为某品牌眼凝胶b为某品牌调理精华液)

　　Fig6. Chromatograms of cosmetic sample(a Eye gel, b Essence) 结论 对比已有的IPBC检测方法，由于IPBC作为复配防腐剂在化妆品中的加入量极少(<<0.05%)，单纯用甲醇超声提取进行样品前处理后，使用文献中的仪器检测方法或本文中的仪器检测方法，无法满足IPBC最低检出浓度。本文中样品前处理方法，操作步骤少、快捷、方便，最重要的是能满足日常含有极少IPBC化妆品的检测，能够检出浓度足够低的IPBC，且有效避免化妆品基质等其他杂质干扰，降低化妆品成分可能堵塞色谱柱的风险，有效地保护了色谱柱。 Table2.The average recoveries and RSDs of blank samples spiked standards that about 4 types include 8 kinds of cosmetics at three concentration levels

　　表2 四类型8种化妆品样品防腐剂IPBC的添加浓度、平均回收率、相对标准偏差 样品 加标(mg) 平均回收率R/% RSD St/% 膏霜1 0.25 0.5 0.75 103 99 96 4.83 2.15 1.47 膏霜2 102 93 90 0.70 1.52 1.57 护发素1 0.25 0.5 0.75 89 94 91 1.59 2.27 0.78 护发素2 82 83 88 0.87 4.29 0.81 香波1 0.25 0.5 0.75 88 86 86 0.81 4.93 2.48 香波2 87 88 85 0.62 0.81 3.33 化妆水1 0.25 0.5 0.75 106 99 97 2.01 2.86 0.73 化妆水2 109 103 101 2.59 2.75 2.11

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