摘 要：文章主从历史和目前的观点出发，以鼠等实验动物、家畜和家禽的研究数据为基础，详细论述了小肽的吸收利用和肽转运蛋研究概况。

　　关键饲：小肠;肽;肽转运蛋白;氨基酸;

　　Abstract: The purpose of this review is to describe, both from a historical and current perspective, the absorption and transportation of intestinal peptide, peptide transporter, which has been characterized primarily in laboratory species such as the rat and relate these findings to livestock and poultry.

　　Key word: intestine; peptide; peptide transporter; amino acid

　　“如果我们断续只关注游离氨基酸的营养生理作用，我们的眼光将永远仅限于游离氨基酸，就会忽略小肽在营养生理上的重要性。” Matthews意味深长的阐述了小肽在总氨基酸吸收利用中的重要地位[1]。1994年，小肠寡肽转运蛋白1(PepT1)被Fei等学者克隆鉴定出来，结果表明，小肽穿过肠细胞刷状缘囊膜的吸收过程中存在载体介导机制[2]。尽管早在1950年Newey和Smyth[3]就报道了肽转运的证据，但是氨基酸可以以小肽形式被吸收利用在二十世纪八十年代才慢慢的被接受。小肽除了通过PepT1转运外，也可通过细胞旁路(paracellular movement)和细胞渗透肽(cell-penetrating peptides，CPP)等替代途径转运(如图1)。本文主从历史和目前的观点出发，以鼠等实验动物、家畜和家禽的研究数据为基础，详细论述了小肽的吸收利用和肽转运蛋研究概况。除作了另外标注外，文中的肽主要是指二肽和三肽。

A通过PepT1主动运输输 B通过CPP的跨膜运输 C细胞旁路运输

　　图1 肠细胞中小肽的主要吸收途径

　　1. 肽的转运和氨基酸的运输

　　虽然游离氨基酸转运蛋白具有底物特异性，但是，PepT1可潜在转运400种二肽和8000种三肽[4]。就能效而言，与单个氨基酸吸收利用相比，同样的能量支出，PepT1一次可转运2或3个氨基酸进入细胞。另外，如果动物遭受了游离氨基酸运输的缺乏，PepT1可转运足够的日粮氨基酸，从而补尝其不足带来的不良影响。以具有同样氨基酸组成的氨基酸混合物为对照组，Hara等[5]和Kodera等[6]分别研究了鼠对蛋清蛋白水解物与大豆蛋白水解物的吸收利用，Rerat等[7]研究了生长猪对乳蛋白水解物的吸收利用，结果表明，以小肽形式运输的氨基酸进入门脉血的速率更快。但是，Zhao等[8]比较研究了狗对完整大豆蛋白和水解大豆蛋白的吸收利用差异，结果发现，存在负载相关的小肠转运减速。有趣的是，完整大豆蛋白对小肠转运的减速更显著，这给消化是养分同化的限速步骤提供了有力证据。此外，以水解形式灌注后，大量的氨基酸被吸收到小肠近端，这暗示，寡肽形式的氨基酸更易被吸收利用。

　　2. 小肽与门脉回流组织中的氨基酸流

　　用生长猪研究发现，日粮中90%的谷氨酸出现在门脉回流组织(PDV)中，小肠粘膜细胞主要以氨基酸作为能源物质，此外，氨基酸在肠粘膜蛋白和核苷的合成、聚酰胺以及肠道免疫系统的维持中具有举足轻重的地位[9]。用反刍动物如生长黑白花奶牛[10]、泌乳黑白花奶牛[11]、弗里斯兰奶牛[12]、绵羊[13]和牦牛[14]研究表明，门脉血中85%的氨基酸以小肽形式存在。这些研究还发现，门静脉血中游离氨基酸与肽结合氨基酸的总量大于所采食蛋白的量，原因是胃肠道、脾和胰脏中不停的在进行组织蛋白周转。DiRienzo[15]对牛和绵羊的肠系膜和PDV中非肠系膜部分中游离氨基酸和肽结合氨基酸进行了定量分析，有两个重要发现：①两种形式的氨基酸从空肠、回肠、盲肠、结肠和胰腺中流入肠系膜静脉中的量相似;②从瘤胃、网胃、皱胃、网状组织、十二指肠和脾脏中流入PDV非肠系膜静脉中的肽结合氨基酸量占绝大部分。这个研究证实了肽结合氨基酸对门静脉血氨基酸的贡献，同时，也表明瘤胃和网胃在肽合氨基酸吸收中的重要性。该结论后来被Matthews等[16]、McCollum等[17]和Tagari等[11,18]等进一步证实，在反刍动物营养领域引起了较大的影响。Matthews等[16]研究了绵羊对2种二肽和游离Met的吸收，结果发现，它们以线性非饱和非载体介导形式穿过瘤胃和重瓣胃上皮细胞，且以重瓣胃上皮细胞的量大。然而 ，Matthews等[19]又发现，重瓣胃上皮细胞存在寡肽转运蛋白。

　　3. 血浆中的小肽

　　血浆中循环肽可能并没有水解，红血球对血浆肽的清除也可以忽略不计[20]。小肽可能运输到靶细胞后再水解成游离氨基酸，然后用于蛋白质的合成代谢，靶细胞对小肽的利用程度受日粮状态的影响[21]。犊牛饲喂干草-玉米-豆粕型日粮后，血液中肽结合氨基酸的量是游离氨基酸量的3倍[22]，结果提示，日粮影响了循环肽的浓度和肝外组织小肽的可用性以及不同的组织对小肽的利用与清除具有选择性。

　　另外，小肽的疏水性也可能与日粮中的蛋白源有关，它影响了组织对小肽的吸收利用。Pan等[23]报道，对粘膜水解具有抵抗力的疏水性肽的吸收利用速率大于亲水性肽。然而，Burston等[24]研究表明，疏水性与肽的转运速率之间的相关性并不存在于hamster大鼠回肠中。Pan等[25]用含蛋氨酸的二肽作为蛋氨酸源研究了绵羊骨骼肌细胞对小肽的吸收，结果表明分子结构对小肽的吸收利用具有影响，三种不同的细胞对蛋氨酸二肽的吸收、水解和利用具有明显的细胞特异性差异。

　　4. 乳腺细胞对寡肽的利用

　　一个有趣的现象就是小肽能够给哺乳动物乳腺组织提供必须氨基酸用于乳蛋白的合成。因为血液中的游离氨基酸根本无法满足乳蛋白合成对氨基酸的需要[26,27,28]。Wang等[29]用哺乳鼠乳腺组织对7种二肽蛋氨酸进行了研究，结果发现，有5种二肽蛋氨酸在剌激[3H]-Leu给合到蛋白的能力没有差异，但比游离蛋氨酸强。尽管在乳腺细胞中没有鉴定出PepT1 mRNA[30]，但是在山羊乳腺细胞中鉴定出氨基肽酶N mRNA，并受循环氨基酸结构形式的影响[31]。在山羊泌乳的早期和未期，乳蛋白中Met、His、Thr、Pro和Phe不能用来评定游离氨基酸的吸收。另外，采用同位素示踪技术研究乳蛋白合成的氨基酸源表明，乳酪蛋白发生了同位素稀释，这说明还有其它非标记氨基酸源参于了乳蛋白的合成[31,32]。Mabjeesh等[31]估计，乳酪蛋白中大约有7～18%的Met来于寡肽。

　　Tagari等[11,18]报道，肽结合氨基酸是PDV中氨基酸流的重要组成部位，也在乳蛋白合成中起关键作用。2004年，他比较研究了奶牛饲喂蒸汽压片玉米和蒸汽轧滚玉米后PDV氨基酸流中游离氨基酸量与肽结合氨基酸量之间的差异，结果是PDV中总游离必需氨基酸流量分别是571.1g/12h和366.4g/12h，必需肽结合氨基酸流量分别是69.3±10.8g/12h和51.5±13.2g/12h，乳腺必需肽结合氨基酸吸收量以饲喂蒸汽压片玉米组大，分别是25 g/12h和15.1 g/12h。2008年，用高粱替代玉米进行了同样的研究，结果是PDV中游离氨基酸流量以饲喂干轧滚高粱组的奶牛高，而肽结合氨基酸流量以蒸汽压片高粱组奶牛高。但是，这些研究中，两处理奶牛间的乳产量并没有明显差异，Tagari等把这种现象归咎于肽结合氨基酸的补尝效应，它可以补尝血浆游离氨基酸的不足。由此可知，肽结合氨基到在乳蛋白合成中起重要作用。

　　5. PepT1的克隆与特性

　　肽转运蛋白是质子藕联寡肽超级家族(也叫肽转运蛋白家族)中的成员[33]。表1总结了目前已分析鉴定出来的肽转运蛋白。第一个PepT1 mRNA是Fei等[2]通过把兔小肠分离出来的mRNA微注入到爪蟾卵母细胞中克隆得到，经分析预测，它由12个跨膜域(TMD)组成。Matthews等[19]把绵羊网胃上皮细胞RNA微注入到爪蟾卵母细胞并编码表达了肽转运蛋白。他们发现，Gly-Sar的吸收具有饱和机制(Kt=0.4mmol)，肌肽、甲二磺酰甘氨酸和甘氨酰亮氨酸对其有抑制作用，抑制率分别是44%、94%和91%，但不受游离甘氨酸的影响。Pan等[34]进一步研究了绵羊网胃上皮细胞RNA是否编码表达肽转运蛋白，结论与Matthews等[19]一致。

　　表1 质子依赖型寡肽转运蛋白家族 名称 别名 底物 转运类型和藕联离子 组织分布和细胞表达 PePT1 寡肽转运白1

　　或H+肽转运蛋白1 二肽和三肽质子 协同转运，H+ 小肠，肾顶膜，

　　溶酶体膜 PePT2 寡肽转运白2

　　或H+肽转运蛋白2 二肽和三肽质子 协同转运，H+ 肾，肺，脑，乳腺

　　支气管上皮细胞 PePT3 肽/组氨酸转运白2

　　或人肽转运蛋白3或PHT2 组氨酸，二肽和三肽质子 协同转运，H+ 肺，脾，胸腺，脑，肝，肾小腺，心脏 PePT4 肽/组氨酸转运白1

　　或人肽转运蛋白4或PHT1 组氨酸，二肽和三肽质子 协同转运，H+ 脑，视网膜，胎盘 此外，PepT1除在鼠、鸡、火鸡、狗、人、猪、牛、猴、鳕、斑马鱼等许多脊椎动物上克隆得到外(表2)，也在细菌、酵母、植物和无脊椎动物上发现，其氨基酸组成数量从707～729不等。近年来发现，原核H+依赖性肽转蛋白—YdgR的结构特征与哺乳动物的PepT1非常相似[35]

　　表2 几种动物小肠肽转运蛋白的克隆比较 种 类 cDNA AA数目 基因库 来 源 兔 2746 707 U06467(NM-001082337) Boll等[36] 绵羊 2829 707 AY027496(NM-001009758) Pan等[37] 人 3104 708 U21936(NM-005073) Liang等[38] 猪 2698 708 AY180903(NM-214347) Klang等[39] 食蟹猴 2127 708 AY289936 Zhang等[40] 猕猴 3108 708 AY289934 Zhang等[40] 鼠(mouse) 3128 709 AF205540(NM-053079) Fei等[41] 耗子(rat) 3032 710 D50664(NM-057121) Saito等[42] 鸡 2914 714 AY029615(NM-204365) Chen等[43] 火鸡 2921 714 AY157977 Van等[44] 斑马鱼 2636 718 AY300011 Verri等[45] 鳕鱼 2838 729 AY921634 Ronnestad等[46] 6. PepT1的底物特异性

　　PepT1可以转运400种二肽和8000种三肽。在PepT1的底物结合区域，水可屏蔽氨基酸侧链的质荷，因此，水被认为在PepT1的广泛特异性上具有重要作用(Daniel等，2004)。此外，Zn2+、Mn2+和Cu2+等金属离子也能与肽转运蛋白相互作用，从而加强肽的吸收[47]。

　　肽的转运具有质子依赖性。这一结论通过将PepT1 cRNA注入卵母细胞，然后用微电极电压钳技术检测了Gly-Sar吸收的H+电流得到证实[37,39,43,44,48]。PepT1转运的中性和阳离子氨基酸的适宜质子底物比率是1，而阴离子氨基酸的适宜质子底物比率是2。肽和H+被PepT1吸收后，H+在刷状缘囊膜通过Na+/H+交换运出细胞，反过来，在基底膜上Na+通过Na+/K+ATP酶带出细胞，3个 Na+交换2个K+，最终恢复电化学梯度。用爪蟾卵母细胞研究发现，绵羊[37]、兔[49]和人类[50]的PepT1偏爱pH5.5～6.0、中性和酸性肽。鸡的PepT1在pH6和6.5的环境中对[3H]-Gly-Sar的吸收运输效率比在pH5.0、5.5、7.0和7.5的环境中大[33]。

　　Vig等[51]比较研究了PepT1的底物特异性和结构特征。他以Gly-Sar作参考底物，用 MDCK细胞对73种肽(大多是二肽)进行了测定研究，结果表明，所有的二肽和三肽都是PepT1的底物。他推断，N-端疏水性氨基酸能加强PepT1的活性，中性氨基酸是PepT1的更好底物，另外，芳香性氨基酸也能加强PepT1的活性，实验中Trp-Trp不能被PepT1运输的原因是二肽的总体积超过了PepT1蛋白的总容纳能力。

　　Terada等[52]研究发现，半数的PepT1的N-端有TMD，该区域的1～6位包含有与pH变化相关的氨基酸残基。然而，C-端TMD中的7～9位被认为在决定底物亲和力上起重要作用[53]。His残基是肽转运蛋白底物键合区域中相当重要的残基。Meredith等[54]用组氨酸修改剂—焦碳酸二乙酯对肾刷状缘膜囊泡进行预处理后研究表明，PepT1失去了肽转运能力。对人类的PepT1 His-57[55]、鼠的PepT1 His-57和His-121[56]、以及兔的PepT1 His-57[57]进行诱变研究都发现肽转运蛋白的活性降低或失去。但用免疫染色研究表明，质膜上的肽转运蛋白数量并没有受到His-57或His-121诱变的损伤[55]。所有的结果指示，His诱变是蛋白质功能受到损伤，而不是蛋白质的生产。Chen等[57]还报道，兔的PepT1 His-121诱变后，对阴离子底物亲和力显著下降，于是他认为，His-57对H+至关重要。Doring等[58]报道，兔的PepT1 氨基酸残基的1～59位是底物键合域的重要部分，60～91位的氨基酸残基是肽吸收侧面与pH相关的重要部分。这与Bolger等[59]的研究一致。

　　另外，还有其它一些结构特征影响肽转运蛋白的活性。与包含有氨基酸D-异构体的肽转运蛋白相比，氨基酸 L-异构体肽转运蛋白对底物肽的亲和力更强[60]。Terada等[61]研究报道，与对应体Gly-Gly和Met-Ala相比，N-甲基-Gly-Gly和N-甲酸基-Met-Ala对PepT1的亲和力降低。

　　7. 结语

　　总之，小肽具有游离氨基酸不替代的生理作用，尤其对乳蛋白的合成更是举足轻重。肽转运蛋白是小肽吸收转运的重要载体，那么，它在机体组织和细胞中的分布如何?日粮、激素、生长发育和疾病对肽转运蛋的表达与分布有什么影响?小肽吸收的替代途径具体怎样吸收转运寡肽?敬请继续关注。

　　参考文献

　　[1] Matthews, D. M. Protein Absorption: Development and Present State of the Subject[C]. Wiley-Liss, New York, NY.1991,126～137.

　　[2] Fei, Y. J., Y. Kanai, S. Nussberger etal. Expression cloning of a mammalian proton-coupled oligopeptide transporter[J].Nature,1994,368:563～566.