摘要: 为探讨番茄类囊体膜脂ω-3脂肪酸去饱和酶基因(LeFAD7基因)在干旱胁迫下对番茄抗旱性的影响，以野生型(WT)和转正义LeFAD7基因株系T(+)-12为试材,测定了番茄叶片类囊体膜脂脂肪酸组成，干旱胁迫后的光合参数，叶绿素荧光参数和活性氧清除酶(SOD、CAT和POD)活性的含量变化。转正义基因番茄植株类囊体膜脂中亚麻酸(18:3)含量升高，亚油酸(18:2)含量下降，导致膜脂脂肪酸不饱和度升高。与WT相比,干旱胁迫下转正义基因番茄植株的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和光合速率(Pn)下降程度较小，转正义基因番茄植株能维持较高的抗氧化酶活性。干旱胁迫下LeFAD7基因对番茄起一定的保护作用。

　　关键词：LeFAD7基因 ;类囊体膜脂组成;荧光参数 ;光合速率 ;抗氧化酶;干旱胁迫

　　干旱胁迫影响植物生长发育，造成作物严重减产。全球干旱半干旱地区约占土地总面积的36%，占耕地面积的43%[1]。在我国干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中占首位，仅次于生物胁迫病虫害造成的损失。番茄是保护地栽培的主要蔬菜之一, 植物生物膜是细胞与外界环境联系的界面，各种逆境对细胞的伤害多始于细胞膜。在各种生物膜中，作为光化学反应场所的类囊体膜被认为对植物光合作用影响最大。类囊体膜主要包含单半乳糖基甘油二脂(MGDG)，双半乳糖基甘油二脂(DGDG)，磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰甘油(PG)和硫代异鼠李糖基甘油二脂(SQDG)[2] ，其中糖脂所占比重很大, MGDG和DGDG可达总脂的75%。类囊体类脂含有较多的多不饱和脂肪酸,主要是亚麻酸,可达90%以上。多不饱和脂肪酸占如此高的比例被认为与膜的高度流动性有关,是类囊体膜上进行高效的光化学反应的基本特征[2]。其中 MGDG 可以与PSⅡ复合体外围相连，DGDG 与PSⅡ复合体的联系是内在的，它是PSⅡ复合体的内部组分[3]。SQDG与偶联因子紧密结合,PG与LHCⅡ呈特异性结合。类囊体膜上磷脂的存在使双层膜向Ⅱ型六角结构转变的倾向大大增加[4]。非双层脂降低膜的稳定性，使膜具有更大的通透性。

　　干旱胁迫下研究渗透调节物质的影响的较多,但干旱胁迫下植物类囊体膜脂不饱和度的改变对植物抗旱性 的影响报道很少,有待深入研究和进一步探讨。

　　叶绿体omega-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD7)是不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶,它催化18:2形成18:3,改变类囊体膜脂不饱和脂肪酸含量,从而改变膜的流动性。通过本实验室已获得的转正义(LeFAD7)番茄植株已验证了番茄叶绿体omega-3脂肪酸去饱和酶基因过分表达可以提高番茄的耐冷性，反之提高番茄的耐热性[5]。本次实验再观察一下该基因与番茄干旱胁迫下生理作用的关系,从而探讨番茄类囊体膜组成与抗旱性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1实验材料及处理

　　供试材料为番茄(Lycopersicon esculentum)品种“天津白果”野生型(WT)及其转正义LeFAD7基因株系T(+)-12，先前的温度胁迫实验已证明T(+)-12是目的基因表达较好的株系。供试材料种子来源于本实验室刘训言博士等利用转基因技术获得植株培育的种子。种子先用50℃热水进行表面消毒10min。浸种10h后,将大小基本一致的番茄种子置于铺有滤纸的培养皿中,再将滤纸用水稍微润湿,上加一层湿滤纸,28℃暗中催芽3～5d。然后将长至2cm左右的番茄幼苗移入花盆中进行栽培。 自然温光条件下生长,正常肥水管理,以生长40～50d的幼苗作试材, 用0、10%、20%和30%(W/V)PEG-6000(1/2Hoagland营养液配置)处理48h，每处理3次重复。选用生长点以下第2～3片完全展开叶测定各项指标。

　　1.2测定项目与方法

　　1.2.1类囊体膜脂的提取和分析 按苏维埃等 [6]的方法提取极性脂。类脂分析按朱亚芳和苏维埃 [7]的方法。提取物在薄层板上进行双向层析(TLC)，所得类脂经苯：石油醚(1：1，V：V)提取，再用400mmol·L-1的KOH/甲醇甲脂化，以适量的花生酸甲脂为内标。色谱条件为DB-23型3m×0.25mm×0.25um的石英毛细管柱;柱温190℃,进样口和监测器温度均为220℃;载气为高纯氮，氮气流速300mL·min-1;进样方式为直接注射，归一化法计算结果。

　　1.2.2 番茄叶片水势的测定(压力室法) 参照郝再彬[8]主编《植物生理学实验技术》的方法。于傍晚采取生长点以下第2～3片完全展开叶，先称鲜重，用水饱和后称饱和重，装样，加压(以0.2MPa/min左右的速度缓慢加压)，读数(样品切口端形成水膜时，压力表的读数即为被测样品水势的绝对值)，重复3次，取平均后即为该样品的水势值。

　　1.2.3 叶绿素荧光参数的测定 用英国Hansatech公司生产的脉冲调制式荧光仪FMS2测定叶绿素荧光参数。将处理后的番茄幼苗叶片在800μmol·m-2·s-1光下适应后，测定光下荧光参数Fs、Fm′，再打远红光3s测定Fo′，然后暗适应15min测定Fo、Fm、Fv/Fm等参数。根据相关公式推算ΦPSⅡ。ΦPSⅡ= (Fm′- Fs)/ Fm′

　　1.2.4净光合速率测定 采用美国PP Systems公司生产的CIRAS-2便携式光合作用系统在室温和大气CO2浓度下测定净光合速率(Pn)，测定时的光照强度达到被测材料的光饱和点以上(800μmol·m-2·s-1),叶温25℃，氧气含量21%，CO2浓度360μmol·mol-1。

　　1.2.5抗氧化酶活力的影响.参照郝再彬[8]主编《植物生理学实验技术》的方法。0.5g叶片于预冷的研钵中,加4ml磷酸缓冲液(PH=7.8),在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml,于4℃下 8000×g离心15min，上清液即为粗提液。

　　1)SOD(超氧化物岐化酶)提取和活性测定。将郝再彬等(2004)[8]的方法稍作修改。取上清液1.5ml与反应液(0.05M磷酸缓冲液,130uMMet溶液,75uMEDTA-Na2,20UM核黄素,蒸馏水定容至3ml)在40umolm-2s-1光强下反应30min，以不照光的对照管(磷酸缓冲液代替酶液)用UV-1601型分光光度计在 560nm比色。计算其单位时间内吸光度的变化。以 抑制NBT光还原的50%为酶的一个活力单位。

　　2) POD酶(过氧化物酶)活性的测定。将郝再彬等(2004)[8]的方法稍作修改。测定系统含20ul酶提取液和3mlPOD反应液(28ul愈创木酚和19ul30%H2O2,用0.1M磷酸缓冲液(PH6.0)定容至50ml)470nm下比色, 计算其单位时间内吸光度的变化。1min内A 4 70减少1的酶量为一个活力单位。

　　3) CAT酶(过氧化氢酶)活性的测定。将郝再彬等(2004)[5] 的方法稍作修改.测定系统含0.3ml酶提取液和2.7mlCAT反应液(1mlH2O2(30mM)和1.7ml磷酸缓冲液)。在240nm下比色。计算其单位时间内吸光度的变化.以1min内A240减少1的酶量为一个活力单位。

　　1.2.6细胞膜透性的测定 参照郝再彬[8]主编《植物生理学实验技术》的方法。用直径为0.8cm的打孔器避开主脉,打取用去离子水冲洗干净的叶圆片4片,放入洁净的具塞试管中,加入5 mL 含土温(-80)的去离子水,室温下平衡2h，期间多次摇动试管，用DDS-307型电导率仪测其初电导值。测毕后置沸水浴中30 min，冷却至室温，再测其终电导值。以相对电导率表示细胞膜透性，并计算伤害度。相对电导率(%)=(初电导率/终电导率)×100%;伤害度(%)=(处理相对电导率-对照相对电导率)/(100-对照相对电导率)。

　　2. 结果与分析

　　2.1干旱胁迫下转基因番茄水势的变化

 1/4    1 2 3 4 下一页 尾页