摘要:为建立一种简便、快捷、灵敏的CS的测定方法,研究了天青Ⅰ染色剂直接测定CS含量的分光光度法,二者能特异性结合成蓝紫色复合物,该复合物在特定波长处有最大光吸收,通过测定吸光度值可测CS含量。结果天青Ⅰ-CS复合物在波长547nm处有最大光吸收,且在10mg/L~100mg/L范围内,具有良好的正相关线性关系,回归方程是y = 0.0404x + 0.2483,R2=0.9937;该测定方法在5h内稳定性、重现性测定结果P﹥0.05,说明数据可靠,加样平均回收率达94.34%,是一种简便、快捷、灵敏的测定方法。
关键词:分光光度法;硫酸软骨素;测定;天青Ⅰ
硫酸软骨素(Chondronitin Sulfate,CS)是一种广泛存在于动物软骨组织中的酸性粘多糖【1】。以蛋白聚糖聚集体形式存在于软骨、腱、韧带和主动脉等组织的基质中,由20~60个D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基己糖以1,3糖苷键连成的重复二糖组成【2、3】。广泛应用于食品、医药和化妆品行业中,能防治关节炎【4、5】,
高血脂【6】、牛皮癣【7】等疾病并能促进生发【8】。在食品工业上,CS是具有保健功能的新型天然食品添加剂【9】、增稠剂,如果营养中缺少,皮肤就容易起皱纹。
因其安全性、可靠性高,近年来消费需求量急剧飙升。
从现有测定方法看,利用其软骨素二糖、氨基己糖、葡萄糖醛酸、硫酸基、阴性基团等分子结构单位可以直接或间接的测定CS含量【10】。以软骨素二糖为指标的方法如潘自国等人【11】是先将CS降解成软骨素二糖单位,通过HPLC或RP-HPLC法测定,间接得到CS的含量,该方法的缺点是由于受前期降解程度的影响,其准确度值得商榷,而且操作繁琐,不适合广泛应用;以氨基己糖、葡萄糖醛酸和硫酸基为测定指标的方法原理相似,均需要将CS降解,如陆钊等人【12】所用咔唑法、间苯三酚法【13】以及Elson-Morgan法【14】,多是以强酸降解CS的糖链,将其分子中的氨基己糖、葡萄糖醛酸或硫酸基等基团暴露并与成色物质结合,通过测定溶液特征吸光值,再根据各基团与软骨素二糖单位的分子量之比换算间接得到CS含量,该类测定方法操作虽比前述方法简便,但是结果仍然受CS降解程度影响并受含相同基团的外来杂质影响较大,其准确度仍值得商榷;而以阴性基团为基础的方法主要有结晶紫分光光度法【15】、维多利亚蓝B分光光度法【16】、吖啶橙分光光度法【17】、中性红分光光度法【18】和碱性艳蓝BO分光光度法【19】等,是利用阳性染料或乳化剂与CS分子中羧基和硫酸基等阴性基团反应结合成复合物,复合物有特征吸收值,从而测定CS含量。该类方法属于直接测定法,操作较为简便,但受复合物结合强度和稳定性的影响,重现性和稳定性低,从而结果准确性低。
天青Ⅰ是一种生物染色剂,呈绿色光泽的深棕色结晶,在水溶液中呈蓝色,微溶于乙醇显红棕色荧光。带正电荷,而CS的硫酸根和羧基带负电荷,二者通过静电引力相互作用,形成稳定的天青Ⅰ-CS复合物并发生变色,且有其特征吸收光谱。
笔者利用天青Ⅰ试剂能与CS特异性结合形成具有特征光吸收的蓝紫色复合物的性质,建立了一种简便、快捷、灵敏的测定CS含量的分光光度法。
1. 仪器和药品
药品:硫酸软骨素标准品(Sigma公司,含量>99%);天青Ⅰ染色剂(Azure Ⅰ,AⅠ,BS,国药集团化学试剂有限公司);猪CS样品(自制);硫酸软骨素注射液(西安博森制药,规格2ml/支,含量为1.40mg);康得灵复方片(上海实业联合集团长城药业有限公司,规格0.12g/片)。
仪器:紫外分光光度仪(TU-1810S 北京普析通用仪器有限责任公司);
2. 方法
2.1 溶液配制
天青Ⅰ储备液:称取天青Ⅰ染色剂5.0000g,溶解定容至100ml,4℃冰箱中静置1w以上,过滤备用。
天青Ⅰ应用液:取制备好的天青Ⅰ储备液2ml,定容至100ml。
CS标准溶液:称取1.0000gCS标准品,定容至100ml。
CS样品溶液:称取110℃下干燥至恒重的猪CS样品1.0000g,定容至100ml。
注射液待测样品液:取硫酸软骨素注射液1ml,蒸馏水稀释至10ml;
康得灵复方片待测样品液:取康得灵复方片一片,少量蒸馏水溶解,过滤掉不溶物,滤液定容至250ml,取5ml,定容至100ml。
2.2 天青Ⅰ吸收光谱测量
取1ml天青Ⅰ应用液稀释后在波长500~800nm范围内扫描其吸收光谱。
2.3 标准曲线绘制
将CS标准溶液稀释,得到10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L和100mg/L等系列稀释液。取1ml 稀释液,加入5ml天青Ⅰ应用液充分混匀后,静止反应15min,以蒸馏水作空白,在特征吸收波长下测吸光度值OD。吸光度值做纵坐标,浓度做横坐标制作标准曲线。
2.4 稳定性试验
取浓度为100mg/L的CS稀释液,室温下每30min测定OD547一次。
2.5 重现性测定
选择CS标准溶液稀释液浓度100mg/L、50mg/L和10mg/L,分别重复测定10次。
2.6 回收率测定
取10ml具塞试管7支,分别加入50mg/L的猪CS样品溶液0.20ml,2~4号管各加入浓度为1.0g/LCS标准溶液0.20ml,5~7号管各加入CS标准溶液0.10ml,重复测定OD547,计算回收率。
结果和分析
3.1.1 测定波长的确定
吸光度值A
波长/nm
图1 天青Ⅰ吸收光谱曲线
吸光度值A
波长/nm
图2 天青Ⅰ-CS复合物的吸收光谱
天青Ⅰ试剂在615nm处最大光吸收,如图1。天青Ⅰ试剂与CS特异性结合的蓝紫色复合物在547nm处有最大光吸收峰,如图2。从吸收光谱图中可以看到天青Ⅰ和天青Ⅰ-CS复合物有部分吸收重叠,在实际应用时,由于在其最大吸收波长处的最大吸收波长天青Ⅰ应用液本身就比天青Ⅰ-CS复合物的吸光度值低,加上在天青Ⅰ-CS复合物的形成过程中会消耗大部分游离的天青Ⅰ,因此该重叠对测定结果的影响可以忽略不计。因此该方法选择在波长547nm处测吸光度。
3.1.2 线性相关性研究
将CS标准溶液稀释液在浓度1~400mg/L的范围内研究了与天青Ⅰ试剂显色后的线性关系。按照2.3所述方法绘制曲线,如图3~6:
图3 CS浓度1~400mg/L范围内线性研究
图4 CS浓度1~10mg/L范围内线性研究
图5 CS浓度10~100mg/L范围内线性研究
图6 CS浓度100~400mg/L范围内线性研究
结果显示:10~100mg/L 范围内,回归方程是y = 0.0404x + 0.2483,R2=0.9937,线性相关性良好;故选取10~100mg/L 范围绘制标准曲线,进行CS含量测定。
3.2 显色稳定性
图7 稳定性测定
稳定性测定结果如图7。结果显示每30min所测得数据的平均值之间P﹥0.05,表明在5h内,天青Ⅰ-CS复合物的吸光度值的平均值之间没有显著差异,即稳定性很好。
3.3 重现性
选择CS稀释液浓度为100mg/L、50mg/L和10mg/L三个系列溶液,进行重复测定10次。结果如图8。
图8 重现性测定
由图可知,同一个系列浓度的测定结果之间P﹥0.05,差异不显著,故每个系列浓度的重现性都很高,说明测定方法的重现性良好并不受待测样品浓度影响。