【分　 类】 化工与理学
【关 键 词】 绵羊；捻转血矛线虫；Hc38；pcDNA3.1；DNA 疫苗
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正文：
摘要: 为了研究基因疫苗对绵羊的免疫保护效果，构建了捻转血矛线虫Hc38基因DNA疫苗。将捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，经酶切、PCR和序列测定等方法鉴定重组载体正确，并免疫鼠8天后用RT-PCR检测到该疫苗在鼠肌肉组织中进行了转录。将纯化的DNA 疫苗肌注绵羊后，用Western blotting和ELISA方法检测疫苗在绵羊体内的翻译和诱导IgG 的产生。2免后2周用10000条捻转血矛线虫第3期幼虫攻击实验动物，检测绵羊粪便虫卵排出、成虫数量等免疫保护性指标。该捻转血矛线虫Hc38DNA 疫苗与对照组比较，免疫组绵羊排出虫卵减少66.6%、成虫减少33.1%。特别值得注意的是免疫组的静脉注射方式产生抗体最高，相应羊的虫卵数和成虫数低。本实验证明Hc38基因DNA疫苗对绵羊虫卵及成虫发育具有明显的抑制作用。
关键词：绵羊；捻转血矛线虫；Hc38；pcDNA3.1；DNA 疫苗
 Protective Effects Of Hc38 DNA Vaccines for Haemonchus contortus in Sheep
Abstract: The study was carried out to construct DNA vaccines for Haemonchus contortus, and test its protective effects in sheep. Hc38 gene putative protain conserved domain of Haemonchus Contortus was inserted into pcDNA3.1. The recombinants were identified by double enzyme digestion,PCR and sequencing. The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-Hc38 was successfully constructed. Transcriptions of the vaccines in mouse muscles were confirmed in eight days by RT-PCR. Lambs were immunized with DNA vaccines about 28 and 14 days before challenged by 10000 H. contortus L3. The expression of vaccines in sheep was analyzed by Western blotting. While the IgG stimulated with the vaccines was checked by ELISA. After  challenge with L3, EPG (eggs per gram feces), L3 hatched from eggs and worm burdens of lambs were counted. And the serum anti-Hc38 antibodies were inspected by ELISA about ten days after the first immunization. After challenged with L3, it was found that EPG and worm burdens of lambs, immunized with Hc38 DNA vaccines reduced by 66.6%and 33.1%, percentage of L3 hatched from eggs was very low respectively, compared with the sheep administered with control and special antibody was highest by intravenous injection.  The results showed that the recombinant plasmids carrying Hc38 gene could inhibite from the egg and growth of H. contortus effectively.
Key words: Sheep；Haemonchus contortus；Hc38； pcDNA3.1；DNA vaccine
   捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是寄生于牛、羊等反刍动物皱胃的一种重要消化道寄生虫，成虫的嗜血性引起动物贫血及贫血综合征，羔羊感染后死亡率达30%以上^[1]。虽然
 

收稿日期：2009-02-16
基金项目：新疆兵团科技局社会发展项目（2006GG31）
作者简介：郑金海（1977-），男，内蒙古锡林浩特人，硕士研究生，主要从事动物寄生虫生物学研究，E-mail：zjhai2006@yahoo.com.cn，电话：0993-6683156；*为通讯作者，E-mail：boxinwen@yahoo.com.cn。
药物治疗取得了较好的效果，但存在严重的药物残留和环境污染问题^[2]。抗药性虫株的出现和蔓延，使得传统的化学治疗受到了严重挑战，给畜牧业生产带来了极大的经济损失^[3]，免疫学方法控制该病将是一种高效环保的防治手段。
Hc38基因是Hartman等（2001年)在研究该线虫的发育调节基因时用Northern杂交得到的，根据该基因在线虫肠上皮微绒毛内呈高丰度表达，推测该基因产物可能与吸血或者免疫逃避机制有关^[4]。薄新文等^[5]（2004年）使用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术首次克隆到Hc38基因的全长cDNA，并用免疫印迹（Western blotting）证明了该基因的读码框ORF（open reading frame）的位置和大小、信号肽的长度、分泌特性以及水解酶裂解位点等，它的196-512位氨基酸残基构成了一个保守结构域，该结构域属于功能未知的pf04910蛋白家族，该蛋白家族目前有14种生物为人类或动物的重大血源性疫病病原或媒介。荣光等^[6](2006年)通过RNA干扰试验发现，干扰组幼虫的绵羊体内捻转血矛线虫虫卵、虫卵孵化率、雌虫数、雄虫数、成虫数较对照组明显减少。赵军民等^[7](2007年)将Hc38基因保守结构域抗原免疫绵羊后，免疫组和对照组在虫卵孵化率、成虫计数等方面差异显著，尤其是雄虫数明显减少，进一步证实该基因与吸血或免疫逃避有关。
核酸疫苗是一种新型疫苗，以MHCⅡ和MHCⅠ途径进行抗原递呈，不但引起体液免疫应答反应，而且可引起机体细胞免疫应答反应，易保存、制备简单等优点使其成为寄生虫疫苗研究的热点之一^[8]，Schistosoma japonicum^[9]，Leishmania donovani^[10]和Plasmodium falciparum^[11]等，Charles等^[12]在寄生虫研究中取得了重要进展。本文在捻转血矛线虫Hc38基因研究的基础上，通过真核表达对其免疫保护作用进行研究。以期望阐明Hc38基因的功能，搞清pf04910蛋白家族基因的功能提供依据，为防治14种人类或动物的重大血源性疫病病原或媒介，同时为捻转血矛线虫的疫苗研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌种  pcDNA3.1（+）质粒购自Invitrogen公司，pMD19T-Hc38、pPROEXHTa-Hc38、E.coli DH_5α由本实验室保存。
1.2 试剂与实验动物  DNA 分子量标准物为MBI公司产品；T₄ DNA 连接酶、限制性内切酶和无DNA 酶RNA 酶为大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司产品；反转录酶M-MLV为Promega公司产品；Trizol试剂为Invitrogen产品；Taq^TM 酶、dNTP、DL2000 DNA maker均购自天根生化科技公司；兔抗羊IgG-HRP为北京博奥森公司产品；重组Hc38蛋白由本实验实制备；卵磷脂购自上海生物工程公司；GenEscort购自南京慧基生物技术有限公司；小鼠4只，购自石河子大学实验动物中心。
1.3 疫苗载体构建与鉴定  设计引物将Hc38基因保守结构域从pMD19T-Hc38上扩增出来，分别将pcDNA3.1、Hc38片段用HindⅢ、XbaⅠ双酶切，回收目的基因片段和载体片段，4℃连接过夜；将连接产物转化E.coli DH_5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的平板，37℃温箱中培养16～20 h；挑单个菌落，37℃摇菌过夜；提取质粒，分别质粒PCR鉴定和HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定，筛选阳性克隆测序；序列测定由上海生工代理。引物如下所示。
P1：5'- CCCAAGCTTCACCATGGGGAAAG -3'；
P2：5'- TGCTCTAGAGGTGCCTTAATCTGGT -3。
1.4  DNA疫苗的制备与纯化  大量培养pcDNA3.1-Hc38重组菌，收集细菌沉淀，按照分子克隆（第三版）^[13]碱裂解法大量提取和PEG法纯化质粒。
1.5 RT-PCR检测DNA疫苗的转录  肌肉多点注射小鼠8d后，取疫苗注射部位肌肉提取RNA，溶于20μl DEPC水。为防止质粒DNA污染，反转录前用无RNase的DNase处理肌肉RNA，然后进行RT-PCR。用于扩增捻转血矛线虫Hc38基因的引物同上。

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